Γονιμοποίηση με κατεψυγμένο σπέρμα…….σκύλου….

 

Κατάψυξη κυττάρων…..“παγωμένη ζωή”

Η επιστήμη της Κρυοβιολογίας ξεκίνησε ουσιαστικά τη δεκαετία του 1940, λίγο μετά τον Δεύτερο Παγκόσμιο Πόλεμο. Ο όρος αυτός χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά από τον sir Alan Parkes, ο οποίος την όρισε ως την επιστήμη, που μελετά την παγωμένη” ζωή. Η κρυοβιολογία έχει καταφέρει, με μεγάλη επιτυχία, την κατάψυξη κυττάρων σε θερμοκρασίες τόσο χαμηλές που καμία περαιτέρω μεταβολική δραστηριότητα δεν μπορεί να συμβεί, με αποτέλεσμα η κυτταρική δραστηριότητα φυσιολογικά να αναστέλλεται σε θερμοκρασίες κάτω των 100^oC. Το εντυπωσιακό είναι ότι όταν τα κύτταρα αποψύχονται μπορούν να επανέλθουν πλήρως στην προ της κατάψυξης κατάσταση. Σε ότι αφορά το σπέρμα, το υγρό άζωτο είναι το κρυογονικό υγρό, που μας επιτρέπει να καταψύχουμε το σπέρμα σε θερμοκρασία -196 °C (77,1 K).

Κατάψυξη σπέρματος σκύλου ……γιατί όχι????

Οι λόγοι, που θα μας οδηγήσουν στην κατάψυξη του σπέρματος, είναι οι ακόλουθοι:

·         Ένας  επιβήτορας μπορεί να αναπαραχθεί σε οποιοδήποτε χρονικό διάστημα, ακόμα και μετά το θάνατο του.

·         Το σπέρμα ταξιδεύει και μεταφέρεται ΠΑΝΤΟΥ. Με αυτόν τον τρόπο υπάρχει δυνατότητα αναπαραγωγής δύο σκύλων, οι οποίοι ζουν οπουδήποτε στη γη, με μοναδική υποχρέωση τη μεταφορά τους στον υπεύθυνο για τη διαδικασία κτηνίατρο.

·         Με μία και μοναδική εκσπερμάτωση ένας αρσενικός σκύλος μπορεί να οδηγήσει σε εγκυμοσύνη περισσότερες του ενός θηλυκές.... Με την κατάψυξη σπέρματος υπάρχει η δυνατότητα παρασκευής περισσότερων της μιας δόσης γονιμοποίησης (ο αριθμός εξαρτάται από την ποσότητα και την ποιότητα του σπέρματος), γεγονός το οποίο δε συμβαίνει με τη φυσική οχεία ή με την τεχνητή σπερματέγχυση νωπού ή ψυγμένου σπέρματος.

·         Ορισμένα βακτήρια και ιοί δεν είναι δυνατόν να επιβιώσουν σε συνθήκες κατάψυξης. Έτσι περιορίζεται σε μεγάλο βαθμό η μεταφορά λοιμογόνων παραγόντων μέσω του σπέρματος.

·         Ως πρόταση για την διατήρηση κάποιων - ελληνικών και όχι μόνο - φυλών σκύλων που είναι προς εξαφάνιση.

 Η διαδικασία της κατάψυξης δεν είναι τόσο πολύπλοκη….χρειάζεται όμως εξειδίκευση και εκπαίδευση….

Δεν είναι δυνατόν να συλλέξουμε ένα δείγμα και να το ψύξουμε ή να το καταψύξουμε έτσι απλά. Χρειάζεται να επεξεργαστούμε το σπέρμα με τέτοιο τρόπο ώστε να το ‘κοιμίσουμε’ αλλά όχι να το σκοτώσουμε.

Το μεγαλύτερο εμπόδιο είναι ο πάγος……….

Το νερό, που φυσιολογικά υπάρχει στα ενδοκυτταρικά διαμερίσματα, σε συνθήκες κατάψυξης, όπως είναι αναμενόμενο, μετατρέπεται σε κρυστάλλους πάγου, γεγονός το οποίο είναι απαγορευτικό. Αν τελικά δημιουργηθούν τότε κατά την απόψυξη το κύτταρο θα εκραγεί και η εξωτερική κυτταρική μεμβράνη του θα καταστραφεί ολοσχερώς. Ο σκοπός λοιπόν είναι πριν την κατάψυξη, το νερό να εξέλθει από το κύτταρο ή να διαμορφωθεί έτσι ο χώρος γύρω από το κύτταρο έτσι ώστε να αποτραπεί ο σχηματισμός των κρυστάλλων. Τα κρυοπροστατευτικά είναι τα μόρια εκείνα τα οποία εισέρχονται στο κύτταρο και αντικαθιστούν τα μόρια νερού. Επομένως κατά τη διάρκεια της κατάψυξης μόρια, όπως η γλυκερόλη, εισέρχονται στο κύτταρο μέσω της ημιδιαπερατής κυτταρικής μεμβράνης και αντικαθιστούν τα μόρια του νερού. Στην απόψυξη συμβαίνει το αντίστροφο φαινόμενο δηλαδή το νερό, που βρίσκεται στο διάλυμα απόψυξης, εισέρχεται πάλι στο κύτταρο και τα μόρια γλυκερόλης απομακρύνονται.

Ένα άλλο πρόβλημα είναι η ώσμωση…..

Kατά τη διάρκεια της μεταβολικής δραστηριότητας του σπέρματος παράγονται ιόντα υδρογόνου, τα οποία οδηγούν σε αύξηση του pH. Η διατήρηση  του pH μεταξύ του 6.9-7.1  επιτυγχάνεται, μετά την πρόσθεση στο διάλυμα χρησιμοποιείται για την κατάψυξη του σπέρματος, ειδικών χημικών ουσιών.

Η ενέργεια και η προστασία δεν είναι ήσσονος σημασίας…..

Απαραίτητες ουσίες, που προστίθενται κατά τη διάρκεια της κατάψυξης είναι τα αντιβιοτικά (απαραίτητα για την αποτροπή της βακτηριακής ανάπτυξης), τα σάκχαρα, τα οποία προσφέρουν ενέργεια και φρέσκο αυγό, το οποίο προστατεύει την μεμβράνη των κυττάρων από το σοκ της ψύξης.

Η διαδικασία πρέπει να είναι γίνεται στο σωστό χρόνο…..

Ο ρυθμός κατάψυξης θα πρέπει να είναι αρκετά γρήγορος ώστε να εμποδίσει την υπερβολική συρρίκνωση των σπερματικών κυττάρων αλλά και αρκετά αργός ώστε να αποτραπεί ο σχηματισμός κρυστάλλων πάγου.

Και όμως μετά από χρόνια είναι γόνιμο…

Σύμφωνα με τα παραπάνω, η μεθοδολογία κατάψυξης, που επιλέγεται, πρέπει να είναι αξιόπιστη αλλά και τα συστατικά, που προστίθενται στο σπέρμα, οφείλουν να είναι τέτοια ώστε το αποψυγμένο σπέρμα να είναι όσο το δυνατόν πιο «γόνιμο». Για παράδειγμα αν πριν την κατάψυξη το δείγμα μας έχει 80% κινητικότητα τότε στην απόψυξη ένα δείγμα κινητικότητας 60% θεωρείται αρκετά ικανοποιητικό και μπορεί να οδηγήσει σε επιτυχή γονιμοποίηση. Το σπέρμα σταδιακά επανέρχεται στην θερμοκρασία του σώματος του ζώου ταξιδεύοντας στο γεννητικό σωλήνα ώστε να γονιμοποιήσει το ωάριο.

 

Αποθηκεύεται σε τράπεζα σπέρματος γιατί είναι πολύτιμο……

Το καταψυγμένο σπέρμα αποθηκεύεται σε straws «καλαμάκια» μέσα σε ειδικά containers, που περιέχουν υγρό άζωτο σε θερμοκρασίες -196^οC. Σε κάθε ένα straw υπάρχει αναγραφόμενος ο κωδικός του αρσενικού, ο οποίος είναι μοναδικός και αντιστοιχεί σε καρτέλα, που αναγράφονται όλα τα στοιχεία του σκύλου, του ιδιοκτήτη καθώς και τα στοιχεία της ποιότητας του σπέρματος. Σε κάθε straw αποθηκεύουμε περίπου 100-150 x 10⁶ σπερματοζωάρια. Ο αριθμός των straws, που θα καταψυχθούν, καθώς και αυτός που θα χρησιμοποιηθεί σε κάθε τεχνητή σπερματέγχυση (συνήθως είναι 2-3 straws/ΤΣ) θα εξαρτηθεί από την ποιότητα του σπέρματος αλλά  και από τον αριθμό των σπερματοζωαρίων ανά εκσπερμάτωση. Αξίζει να σημειωθεί ότι σε κάθε εκσπερμάτωση χρειαζόμαστε τουλάχιστον 250-300 x 10⁶ σπερματοζωάρια φυσιολογικής κινητικότητας και φυσιολογίας.

 

 

 

 

 

 

 

Ένα ‘δυνατό’ σπέρμα καταρρίπτει την μαθηματική αναλογία 1 αρσενικό / 1 θηλυκό σκύλο = 1 γονιμοποίηση

Ο αριθμός των γονιμοποιήσεων από μια εκσπερμάτωση με τη χρήση κατεψυγμένου σπέρματος εξαρτάται από την αρχική ποιότητα του σπέρματος αλλά και από την ευαισθησία του κατά τη διαδικασία της κατάψυξης. Εν ολίγοις μερικά αρσενικά δίνουν τέτοιας ποιότητας σπέρμα, που μετά την απόψυξη έχουν 70% κινητικότητα ενώ μορφολογικά διατηρούν σε μεγάλο ποσοστό τη λειτουργικότητά τους. Στην αντίθετη περίπτωση θα έχουμε ένα ‘αδύναμο’ σπέρμα και τα καλαμάκια που θα χρειαστούμε θα είναι περισσότερα, γεγονός που σημαίνει ότι θα έχουμε μικρότερο αριθμό γονιμοποιήσεων. Στατιστικά με τη χρήση κατεψυγμένου σπέρματος από έναν επιβήτορα επιτυγχάνονται 1 έως 5 γονιμοποιήσεις.

Κατά κανόνα το τελευταίο καλαμάκι (tester straw) αποψύχεται έτσι ώστε να επανεκτιμηθεί η κινητικότητα και η μορφολογία του αποψυγμένου σπέρματος. Με αυτόν τον τρόπο ο ιδιοκτήτης γνωρίζει εκ των προτέρων την ποιότητα του σπέρματος, που είναι αποθηκευμένο και επομένως τις δόσεις γονιμοποίησης, που έχει στη διάθεσή του ο κτηνίατρος.

Είναι αλήθεια ότι τα ποσοστά γονιμοποίησης με τη χρήση κατεψυγμένου σπέρματος είναι αμφίβολα;;;;;;;Δεν θα μπορούσε να είναι διαφορετικά.

Η επιτυχία όμως τη γονιμοποίησης με τη χρήση κατεψυγμένου σπέρματος δεν εξαρτάται μόνο από την ποιότητα του σπέρματος αλλά και:

-από τον ακριβή προσδιορισμό της ωοθυλακιορρηξίας. Ο χρόνος εισόδου του σπέρματος στο γεννητικό σύστημα του θηλυκού πρέπει να είναι τέτοιος ώστε αυτό να είναι έτοιμο να δεχθεί το σπέρμα κι έτσι το αποτέλεσμα να είναι επιτυχές.

-από τη θέση του γεννητικού σωλήνα που επιλέγουμε να τοποθετήσουμε το κατεψυγμένο σπέρμα. Το ποσοστό γονιμοποίησης του σπέρματος, αν αυτό τοποθετηθεί ενδοκολπικά, είναι συνήθως < 25%, γεγονός το οποίο εξηγείται από τη μικρής διάρκειας βιωσιμότητα του αποψυγμένου σπέρματος στο γεννητικό σύστημα (λιγότερο από 12 ώρες). Το ποσοστό γονιμοποίησης του σπέρματος αν αυτό τοποθετηθεί ενδοτραχηλικά ή ακόμα και απευθείας στα κέρατα της μήτρας (χειρουργικά) είναι υψηλότερο του 85%. Η επιλογή της ενδοτραχηλικής σπερματέγχυσης μας προσφέρει  τη δυνατότητα να κάνουμε περισσότερες της μιας σπερματεγχύσης ανάλογα φυσικά με τον αριθμό των γονιμοποιήσεων, που έχουμε στη διάθεσή μας…

 

Ρουμελιώτη Καλλιόπη

Κτηνίατρος D.V.M

****Η κατάψυξη και η αποθήκευση του σπέρματος γίνεται στις εγκαταστάσεις του κέντρου αναπαραγωγής μικρών ζώων, (Κηφισίας 22^Α, Μαρούσι).

Τηλ.επικοινωνίας: 6973 66 33 63 (Μαντζιάρας Γεώργιος), 6944 74 7663( Ρουμελιώτη Καλλιόπη).